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到了三級文明，有關克隆，已經研究到了分子水平，也就是分子克隆！

什么是分子克隆呢？

在分子水平上提供一種純化和擴增特定dna片段的方法。常含有目的基因，用體外重組方法將它們插入克隆載體，形成重組克隆載體，通過轉化與轉導的方式，引入適合的寄主體內得到復制與擴增，然后再從篩選的寄主細胞內分離提純所需的克隆載體，可以得到插入dna的許多拷貝，從而獲得目的基因的擴增。

分子克隆是指分離一個已知dna序列，并以invivo**內方式獲得許多復制品的過程。這一復制過程經常被用于增加并獲取dna片段中的基因，但也可用來增加某些任意的dna序列，如啟動子、非編碼序列、化學合成的寡核苷酸或是隨機的dna片斷。

將dna片段或基因與載體dna分子共價連接，然后引入寄主細胞，再篩選獲得重組的克隆，按克隆的目的可分為dna和cdna克隆兩類。

cdna克隆是以ma為原材料，經體外反轉錄合成互補的dnacdna，再與載體dna分子連接引入寄主細胞。每一cdna反映一種ma的結構，cdna克隆的分布也反映了ma的分布。特點是：

有些生物，如a病毒沒有dna，只能用cdna克隆;

cdna克隆易篩選，因為cdna庫中不包含非結構基因的克隆，而且每一cdna克隆只含一個ma的信息;

cdna能在細菌中表達。cdna僅代表某一發育階段表達出來的遺傳信息，只有基因文庫才包含一個生物的完整遺傳信息。

那么，如何做到這一點呢？

首先是dna片段的制備！

常用以下方法獲得dna片段：1用限制性核酸內切酶將高分子量dna切成一定大小的dna片段;2用物理方法如超聲波取得dna隨機片段;3在已知蛋白質的氨基酸順序情況下。用人工方法合成對應的基因片段;4從ma反轉錄產生cdna。

其次是載體dna的選擇，這里要知道，什么是質粒。

質粒是細菌染色體外遺傳因子。dna呈環狀，大小為1-200千堿基對kb。在細胞中以游離超螺旋狀存在。很容易制備。質粒dna可通過轉化引入寄主菌。在細胞中有兩種狀態，一是‘緊密型‘;二是‘松弛型‘。此外還應具有分子量小，易轉化，有一至多個選擇標記的特點。質粒型載體一般只能攜帶10kb以下的dna片段，適用于構建原核生物基因文庫，cdna庫和次級克隆。

柯斯cos質粒是一類帶有噬菌體dna粘性末端順序的質粒dna分子。是噬菌體-質粒混合物。此類載體分子容量大，可攜帶45kb的外源dna片段。也能象一般質粒一樣攜帶小片段dna，直接轉化寄主菌。這類載體常被用來構建高等生物基因文庫。

而噬菌體dna。常用的λ噬菌體的dna是雙鏈，長約49kb，約含50個基因，其中50%的基因對噬菌體的生長和裂解寄主菌是必需的，分布在噬菌體dna兩端。中間是非必需區，進行改造后組建一系列具有不同特點的載體分子。λ載體系統最適用于構建真核生物基因文庫和cdna庫。

m13噬菌體是一種獨特的載體系統，它只能侵襲具有f基因的大腸桿菌，但不裂解寄主菌。m13dnarf在寄主菌內是雙鏈環狀分子，象質粒一樣自主復制，制備方法同質粒。寄主菌可分泌含單鏈dna的m13噬菌體。又能方便地制備單鏈dna，用于dna順序分析、定點突變和核酸雜交。

接著是dna載體的連接。